Sorun 

Muhtemel neden

Çözüm

Jel üzerinde bant yok

Termal döngüleyici düzgün çalışmıyordu

Pozitif bir kontrol hazırlanmadıysa reaktifleri, önceden düzgün çalıştığı gösterilen şablon ve primerlerle bir kontrol reaksiyonunda test etmeyi düşünün.

Yetersiz şablon veya çok fazla şablon eklendi

Sisteminiz için gereken şablon miktarını titre edin.

DNA için: Şablon kalitesi zayıftı veya inhibitörler içeriyor.

Saf olmayan DNA düzgün bir şekilde çoğalmayabilir. Yeni hazırlanmış DNA kullanın veya başka bir yöntemle izolat şablonu kullanın.

Primer konsantrasyonu çok düşüktü veya dengesizdi

Primer konsantrasyonunun tavsiye edilen aralıkta olduğundan ve her iki PCR primerinin konsantrasyonunun aynı olduğundan emin olun.

Nükleazlar tanıtıldı

Yeni şablon hazırlayın. Nükleazların girmesine karşı önlemleri aldığınızdan emin olun. Başlangıç ​​materyali RNA olduğunda bu özellikle önemlidir.

RNA için: Şablon, EDTA içeren arabellekte

RNA solüsyonunda bulunan EDTA, RT-PCR için gerekli olan Mg2+'yi şelatlayacak ve yetersiz sonuçlara yol açabilir. Telafi etmek için reaksiyonları düzenlerken ilave Mg2+ ekleyin. Ayrıntılar için ürün talimatlarına bakın.

Reaktifler kullanımdan önce uygun şekilde çözülmedi

Reaksiyonları kurmadan önce tüm reaktifleri çözün ve iyice karıştırın.

Primer tavlama sıcaklığı çok yüksekti

Tavlama sıcaklığını 2 °C'lik artışlarla azaltın.

Denatüre etme sıcaklığı optimalin altındaydı

İlk denatürasyon adımının sıcaklığını veya süresini artırmayı deneyin. Bu, özellikle GC açısından zengin şablonlar için kullanışlıdır.

Uzatma süresi çok kısaydı

Uzatma sürelerini artırın. Bu, özellikle uzun PCR için önemli olabilir.

Termal döngüleyici doğru sıcaklıkta değildi

Termal döngüleyiciyi onarın/kalibre edin veya farklı bir makine kullanın.

Jel üzerinde ekstra, spesifik olmayan bantlar

Şablonda ikincil bir siteye hibritlenen primerler

İkincil site için daha az spesifik olan yeni primerler tasarlayın. Tavlama sıcaklığını 2 °C ila 5 °C'lik artışlarla artırın.

DNA kontaminasyonu primerlere veya tamponlara dahil edildi

Bir negatif kontrol reaksiyonu çalıştırın (şablon yok). Kontaminasyon tespit edilirse taze malzemeler hazırlayın.

RNA için: Şablon DNA ile kirlenmiştir

Bir DNaz adımı gerçekleştirin ve DNaz'ı tamamen devre dışı bırakın/kaldırın. Alternatif olarak, farklı bir yöntem kullanarak RNA hazırlayın.

Çok fazla şablon eklendi

Sisteminiz için şablon miktarını titre edin.

Primer konsantrasyonu çok yüksekti

Sisteminiz için primer miktarını titre edin.

Termal döngüleyici doğru sıcaklıkta değildi

Termal döngüleyiciyi onarın/kalibre edin veya farklı bir makine kullanın.

Amplifiye DNA'nın aşırı bulaşması

Çok fazla şablon eklendi

Sisteminiz için şablon miktarını titre edin.

Çok fazla döngü gerçekleştirildi

Döngü sayısını 35'in altına düşürün.

Termal döngü koşulları, termal döngüleyiciniz için ideal değildi

Üreticinin tavsiyelerine göre koşulları optimize edin.

Tavlama sıcaklığı çok düşüktü

Kullanıma Hazır Boncuklar kullanılırken, tavlama sıcaklığının yeniden optimize edilmesi gerekebilir. Tavlama sıcaklığını 2 °C ila 5 °C'lik artışlarla artırın.

Primer konsantrasyonu çok yüksekti

Sisteminiz için primer miktarını titre edin.

Uzatma süresi çok uzundu

Uzatma süresini küçük artışlarla azaltın.

DNA için: Şablon kalitesi düşüktü

Saf olmayan DNA düzgün bir şekilde çoğalmayabilir. Yeni hazırlanmış DNA kullanın veya başka bir yöntemle izolat şablonu kullanın.

Jele çok fazla DNA yüklendi

Daha az numune ile yeniden çalıştırın.

Astar dimerleri görünüyor

Çok fazla primer eklendi/ primer konsantrasyonu çok yüksek

Sisteminiz için primer miktarını titre edin.

Primerler tamamlayıcı örtüşen diziye sahiptir

Kendi kendini tamamlayan iç dizilerden kaçınmak için primerler tasarlayın.