Organizmaların hücresel aktiviteleri gen anlatım mekanizmalarının bir sonucu olarak gerçekleştirilir. Dolayısıyla, dış uyaranlara karşı değişen gen anlatım profillerinin analizi biyolojik araştırmaların önemli bir bölümünü oluşturur. Hücre içerisindeki tüm sistemin nasıl işlendiğinin aydınlatılması için, DNA molekülünde yer alan kalıtsal bilginin hangi koşullarda nasıl, ne zaman ve ne kadar kullanıldığının belirlenmesi moleküler biyoloji çalışmaları için gereklidir. Organizma veya hücre çevresindeki değişen koşullar gen anlatımına yansır.
Gen anlatımı analizi ilk kez Alwine ve diğ. (1977) tarafından Northern melezleme (“Northern blotting”) yöntemi kullanılarak RNA miktarının belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu ise (PZR) 1980'lerde Dr. Kary Mullis tarafından geliştirilen bir tekniktir. PZR belirli bir DNA dizisini tanıma, yüksek sayıda kopyayı hızlı ve doğru bir şekilde sentezleme yeteneği nedeniyle moleküler fotokopi makinesi olarak tanımlanabilir. Moleküler biyolojide ve özellikle genetik çalışmalarında, genetik ve bulaşıcı hastalıkların teşhisinde, genotiplemede ve adli tıpta devrim yaratan bir teknik olarak yerini almıştır.
PCR, tüm canlı hücreler tarafından hücre bölünmesinden önce genetik materyallerini kopyalamak için kullanılan fizyolojik bir süreç olan temel bir DNA replikasyonu biçimine benzer. PZR tekniği; DNA şablonu, DNA polimeraz, primerler ve nükleotidler içeren bir reaksiyon karışımının tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngülerini içerir.
Her PCR döngüsü üç adımdan oluşur;
Denatürasyon: Reaksiyon karışımının 90°C'nin üzerine ısıtılılarak hidrojen bağlarını parçalandığı ve DNA'nın çift sarmalının açıldığı aşamadır.
Primer bağlama: Primer bağlanması için reaksiyon karışımı 45–65 °C'ye soğutulur. İleri ve geri primerler, tamamlayıcı baz eşleşmesi yoluyla DNA'nın zıt ipliklerine hibritlenir.
Uzatma: reaksiyon karışımı, DNA polimeraz enzim aktivitesi için en uygun sıcaklığa doğru 72°C'ye ısıtılır. Polimeraz, primer şablon hibrit kompleksine bağlanır ve daha sonra reaksiyon karışımındaki serbest nükleotidleri kullanarak yeni bir tamamlayıcı iplik oluşturur.
Uzatmanın ardından reaksiyon, denatürasyon aşamasına geri döndürülür ve PCR devam eder. Her döngü, DNA miktarını yaklaşık olarak iki katına çıkarır, çünkü yeni bir DNA dizisi daha sonra bir sonraki döngüde replikasyon için bir şablon görevi görür. Bu da DNA miktarında üstel bir artışa neden olur. Örneğin, 6 döngüden sonra 26 kopya oluşur. PCR ürününün beklenen verimine bağlı olarak toplam 25-40 PCR döngüsü gerçekleştirilir.
Gen anlatımının belirlenmesinde kullanılan bir diğer yöntem ise gerçek zamanlı PZR (GZ PZR; “Real-time PCR”)’dir. Son yıllarda, GZ PZR gen anlatımı analizlerinin yapıldığı biyolojik araştırmalar için güvenilir olarak kullanılan bir yöntemdir. GZ PZR yönteminin temeli, 1985'te Kary Mullis tarafından keşfedilen ve 1993’te Nobel Ödülü almasını sağlayan; hedef DNA parçasından milyonlarca kopya oluşturulmasına olanak tanıyan devrim niteliğindeki PZR yöntemine dayanmaktadır. GZ PZR'nin temel amacı, PZR reaksiyonu sırasında gerçekleşen kopya çoğaltımını anlık olarak izlemektir. Çoğaltılan gen parçalarının anlık olarak izlenmesi floresan boyaların kullanımı ile sağlanır. Amplifikasyon sırasında, floresan sinyalin eşik değerin üzerine çıkacak şekilde artışı, hedef dizinin başlangıç miktarı ile ilişkilidir. GZ PZR ile sınırlı doku örneğinden, özellikle düşük RNA konsantrasyonlarına sahip dokulardaki az sayıdaki mRNA'nın hassas miktar değişimlerinin aydınlatılması için sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. GZ PZR, bağımsız örneklerde bulunan bir hedef gen ürününün farklı miktarlarını doğru bir şekilde ölçmek için kullanılır. GZ PZR yönteminde, numuneler önceden RNA’dan ters transkripsiyonla cDNA’ya çevrilir. Her örnek, yalnızca belirli bir gen bölgesi tanındığında florasan ışıma veren, reaksiyon karışımında bulunan bir florokromla birlikte GZ PZR amplifikasyonuna tabi tutulur. Spesifik hedefin bilinen başlangıç miktarları kullanılarak paralel çalışmalardan bir kalibrasyon eğrisi çizilir. Bu şekilde örnekte bulunan hedef miktarının hesaplanmasına izin verir.
Haluk Çelik, M.Sc.
BİYOMÜHENDİS
