Sıvı kromatografisi (LC), ilk olarak 1900'lerin başında Rus botanikçi Mikhail Semyonovich Tswett tarafından gösterilen bir ayırma tekniğidir. LC, bir numunenin bileşenlerini, sabit faz ve hareketli faz yardımıyla tutma gücündeki farklılıklara göre ayırır. Bu ayırma, numunedeki bileşenlerin bir LC kolonunda ne şekilde ayrıldığı Şekil 1'de gösterilmektedir.
Farklı LC teknikleri mevcuttur ve LC tekniklerinin her birinin tutma ve ayırma ilkeleri farklıdır. Tablo 1, yaygın LC tekniklerinin ve bunların ayırma mekanizmalarının bir listesini sunar. LC'deki mevcut gelişmelerle birlikte, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi daha verimli ve daha yüksek hız, hassasiyet ve çözünürlüğe sahip daha küçük parçacık boyutlarına ve daha yüksek basınca sahip teknolojilere dönüşmüştür. (UHPLC)
Şekil 1 LC'nin nasıl çalıştığına dair bir örnek. Numune (mor renkte) LC kolonuna enjekte edilir ve 2 analit bandına (kırmızı ve mavi) ayrılarak kolondan ayrıştırılır.
Tablo 1 Farklı LC teknikleri türleri ve bunların ayırma mekanizmaları
| LC Tekniklerinin Türü | Ayırma Mekanizması | Yaygın olarak kullanılan |
| Ters Fazlı LC (RPLC) | RPLC için apolar bir sabit faz ve bir polar mobil faz kullanılır. "Benzer benzeri çeker" ilkesine dayalı olarak, numune, molekülün polarite tercihine göre polar hareketli faza veya apolar sabit faza göre ayrılır. Örneğin, apolar moleküller, polar hareketli fazdan ziyade apolar sabit fazda tutulmayı tercih edecektir. Sonuç olarak polar moleküllere göre daha geç ayrıştırılır. | Düşük moleküler ağırlıklı (MW) bileşikler |
| Normal Fazlı LC (NPLC) | NPLC, RPLC'nin tam tersi çalışır. NPLC'de bir polar sabit faz ve bir apolar mobil faz kullanılır. Polar moleküller, apolar moleküllere kıyasla durağan faz tarafından güçlü bir şekilde tutulur. Sonuç olarak, apolar moleküller önce elüe olur. | Steroid hormonları, fosfolipidler, sakkaritler ve tokoferoller |
| Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi (HILIC) | HILIC, NPLC ile aynı prensipte çalışır. Ana fark, güçlü bir şekilde tutulan polar molekülleri etkili bir şekilde ayırmak ve ayrıştırmak için organik mobil faza su eklenmesidir. | polar bileşikler |
| İyon Değişim Kromatografisi (IEC) | IEC, zıt yüklü bir fonksiyonel grup içeren durağan faz için analitin elektrostatik afinitesine dayalı olarak yüklü türleri (iyonları) tutar ve ayırır. Diferansiyel elüsyon, analiti nötralize etmek için mobil fazın pH'ını değiştirerek veya analiti yerinden çıkarmak için iyonik gücü (tuz konsantrasyonu) artırarak indüklenir. | Proteinler, amino asitler, nükleotidler ve inorganik iyonlar |
| Boyuta Bağlı Kromatografi (SEC) | Kullanılan SEC kolonu gözenekli partiküllerle doldurulur. Çeşitli büyüklükteki numuneler kolona aktığında, daha küçük moleküller gözeneklerin derinliklerine nüfuz ettikleri için daha yavaş kolonu terk ederken, büyük moleküller gözeneklere çok fazla girmediklerinden daha hızlı akarlar. Sonuç olarak, daha büyük moleküller kolondan daha erken ayrılır ve bu da numuneleri moleküler boyuta göre etkin bir şekilde sıralar. | Proteinler ve sentetik yüksek polimerler |
Şekil 2 Artan hassasiyette LC sistemleri için çeşitli dedektörler
Şekil 3 Tipik bir LC kromatogramı (kırmızı) ve bir LCMS kütle kromatogramı ve kütle spektrumu (mavi)
LC ile ayırmanın ardından bileşenler, ultraviyole-görünür (UV-VIS), floresan, kırılma indisi, buharlaşmalı ışık saçılımı veya analitlerin özelliklerine dayalı elektriksel iletkenlik gibi optik özellikler kullanılarak tespit edilebilir. Şekil 2, LC için çeşitli dedektörleri göstermektedir. Analit dedektörden geçtiğinde optik özellikte bir değişiklik (örneğin artış veya azalma) gözlemlenecek ve kaydedilecektir.
Bu optik dedektörler kullanılarak elde edilen kromatogramlar, esas olarak, alıkonma süresine dayalı olarak maddeleri tanımlar veya nitelendirir ve pik alanı ve yoğunluğuna göre maddeleri hesaplar. LC kromatogramı (Şekil 3, kırmızı), bu optik dedektörler kullanılarak elde edilen tipik bir kromatogram örneğini gösterir. Optik algılama ile birleştirilmiş LC, tespit edilen bir tepe noktasının yalnızca tek bir bileşen içerdiği kromatografik olarak çözülebilen analitler için büyük niceliksel doğruluk sunar. Bununla birlikte, birden fazla bileşenin yaklaşık olarak aynı anda elue olduğu karmaşık numuneler için gerekli çözünürlüğü elde etmek zordur.
Buna karşılık, kütle spektrometrisi (MS), numune bileşenlerini iyonize eden, elde edilen iyonları kütle-yük oranlarına ( m/z ) göre vakumda ayıran ve her iyonun yoğunluğunu ölçen oldukça hassas bir algılama tekniği sunar. Bir kütle spektrumu, m/z değerlerine karşı bağıl iyon yoğunluklarını gösterir ve her zaman noktasında bir dizi kütle spektrumu oluşturulur (Şekil 3, mavi). Bu bilgi, belirli bir kütleye sahip olan iyonların konsantrasyon seviyesini gösterir ve nitel analiz olarak da bilinen moleküllerin benzersiz tanımlanması için son derece değerlidir. Ayrıca, MS özgüllük ve duyarlılık ile eşzamanlı çok bileşenli analizin kolaylığını sağlar.
LC'nin MS ile birleştirilmesiyle, bu ölçümlerden elde edilen kütle spektrumları, diğer LC detektörleri kullanılarak elde edilen alıkonma sürelerine dayalı kalitatif bilgileri destekleyen, ayrıştırılan bileşenler için moleküler kütle ve yapısal bilgiler sağlar. Bu nedenle, LCMS, LC'nin olağanüstü ayırma çözünürlüğünü MS'nin mükemmel niteliksel yetenekleriyle birleştirir.
Çeviri Makale Kaynağı: https://www.shimadzu.com/an/service-support/technical-support/analysis-basics/basics_of_lcms/ms_and_lcms.html
