Hareketli fazın pompalar vasıtasıyla basınç oluşturarak kolona verildiği ve dedektör sisteminden geçirilerek nitel ve nicel analizlerin gerçekleştirildiği sistemlere Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) adı verilir. Duyarlı oluşu, uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozulabilen maddelerin ayrılmasını sağlaması, doğruluk dereceleri ve kesinlikleri yüksek sonuçlar vermesi nedeniyle, bütün analitik ayırma teknikleri arasında en yaygın kullanılanıdır.
HPLC, uçucu olmayan ve yüksek sıcaklığa maruz kaldığında bozulabilen maddelerin kromatografik olarak ayırarak tesbit ve tayin edilmelerini sağlayan sistemdir. Aminoasitler, karbonhidratlar, proteinler, peptitler, bitki piğmentleri, bitki ve hayvan metabolitleri, glikanlar, nükleik asitler ve ilaç molekülleri gibi küçük moleküller HPLC sistemi ile kolayca ayrılabilir ve tesbit edilebilir.
HPLC sistemlerinin genel bileşenleri; solvent rezervuarı, pompa, oto örnekleyici, kolon fırını, dedektör, atık toplama şişesi, veri toplama ve işleme bilgisayarından oluşur.
Solvent Rezervuar Sistemi;
Modern bir HPLC cihazı, her biri 500 ml veya daha fazla çözücü içeren bir veya daha fazla cam veya paslanmaz çelik rezervuar ile donatılmıştır ve en az 1-2 m3'lük bir solvent rezervuarı miktarı ile bir kaç saat boyunca sürekli çalışmaya olanak tanır.
Bir rezervuar sistemi mobil faz hatları, filtreler ve degazer sisteminden oluşur. Çözünmüş gazları ve çözünmemiş partikülleri sıvılardan uzaklaştırmak için filtreler ve degazer solvent rezervuar sistemine dâhil edilmiştir. Çözünmüş gazlar hareketli faz hatlarında kabarcıklar üretmekte ve böylece kolonda bant genişlemelerine neden olmaktadır. Buna ek olarak, kabarcıklar ve çözünmemiş partiküller dedektör performansını etkiler. Degazerler bir vakum pompalama sistemi, bir damıtma sistemi, ısıtma ve karıştırma için bir cihaz veya yayılma için bir sistemden oluşabilir. Burada çözünmüş gazlar, hareketli ortamda çözünmeyen inert bir gazın ince baloncukları ile çözünerek dışarı atılır.
Pompa;
Pompa solvent rezervuar alanına konulan mobil fazları sabit akışta ve yüksek basınçta kromatografi kolonuna pompalayan sistemlerdir. Bir HPLC pompası iki farklı özelliği bir arada bulundurmalıdır. Bunlar; 350 ya da 500 bar'a kadar yüksek basınç üretebilen sağlam bir cihaz olmalı ve seçilen herhangi bir akış hızında yüksek akış doğruluğu ve hassasiyette çalışabilmeli.
HPLC sisteminde kullanılan iki farklı ayrım tekniği vardır. Bunlar; fazın bileşimine göre izokratik ve dereceli elüsyondur. İzokratik elüsyon, tek pompa kullanılarak bileşimi değişmeyen bir hareketli fazla yapılan ayrımlardır. Dereceli elüsyonda ise en az 2 ayrı pompa kullanılarak polariteleri farklı birden fazla hareketli fazla yapılan ayrımlardır.
Oto Örnekleyici ve Enjektör Sistemi;
HPLC ekipmanının hemen hemen tüm üreticileri, genellikle dikdörtgen veya dairesel bir tepsiye yerleştirilmiş örneklerin program yardımıyla enjeksiyonunun yapılmasına izin veren bir otomatik örnekleyiciye sahiptir. Programlanabilen oto örnekleyiciler numuneleri örnek haznesine doldurmak için hassas motor ile hareket ettirilen şırınga kullanırlar. Enjektörle çekilen hacim kontrol edilerek istenilen miktarda örnek haznesine doldurulur. Düzgün bir şekilde çalışan bir otomatik örnekleyici insan hatasını ortadan kaldırır ve enjeksiyon hassasiyetini ve doğruluğunu arttırır.
Örnek enjeksiyonu ve örneğin muhafazası HPLC için kritik bir parametredir. Enjeksiyon dikkatlice yapılmazsa, en iyi kolon bile kötü bir ayırma üretir. Bir HPLC sisteminde enjektör, yüksek tekrarlanabilirlik ve yüksek basınç altında (4000 psi'ye kadar) 0.1 ml ila 100 ml hacimdeki sıvı enjeksiyonu yapabilmelidir.
HPLC Kolonu;
Sıvı kromatografi kolonları genellikle paslanmaz çelik borudan imal edilmiştir. Kalın cidarlı cam borular bazen düşük basınç uygulamaları için (<600 psi) kullanılırken, çoğu kromatografi kolonu, iç çapları 4 ila 10 mm arasında ve uzunluğu 10-30 cm arası paslanmaz çelikten üretilmiş ve partikül boyutları 5 ila 10 µm aralığında değişen silika dolgu maddeleri ile doldurulmuştur. Son zamanlarda, iç çapı 1 mm ila 4.6 mm ve uzunluğu 3 cm ila 7.5 cm olan yüksek performanslı mikro kolonlar üretilmektedir. 3 μm veya 5 μm'lik partiküllerle paketlenmiş bu kolonlar, hız ve minimum solvent tüketimi avantajına sahiptir. 10 mm veya daha düşük mikropartiküllü sabit fazlar kullanıldığında, 5, 10, 15 veya 25 cm uzunluğunda kolonlar yaygın olarak kullanılır.
Ters-faz sıvı ve normal-faz sıvı kromatografisinde analiz edilecek örnek polaritesinin sabit faz polaritesine yakınlığına göre kolonda alıkonulur ve hareketli faz polaritesine yakın olan maddeler kolonu önce terk eder.
Kolon Fırını;
İyon değişimi, boyut dışlama ve ters faz kolonlarını daha yüksek sıcaklıklarda çalıştırmak ve sıvı-sıvı kolonların sıcaklığını hassas bir şekilde kontrol etmek genellikle analizlerde avantaj sağlar. Bu nedenle, kolon fırınları modern sıvı kromatografisi cihazlarında istenen bir özelliktir. Genel olarak, sıvı kromatografi kolonlarında sıcaklık 20˚C ila 65˚C aralığında çalışılabilir ve sıcaklık değişimi ± 0.2°C hassasiyetle ölçülmelidir. Sabit sıcaklığın korunması nicel analizde özellikle önemlidir, zira sıcaklıktaki değişiklikler pik alanlarının ölçümünü ciddi şekilde etkileyebilir.
Dedektör;
Kolonun sonuna yerleştirilen HPLC detektörü, analitlerin kromatografik sütundan ayrıldıktan sonra tespit edilmesini sağlar. Düzenli olarak kullanılan dedektörler UV, floresan, kütle spektrometresi ve elektrokimyasal detektörlerdir.
Veri Toplama ve İşleme Bilgisayarı;
Dedektörden gelen sinyaller, grafikler veya elektronik entegratörler üzerinde toplanır. Veri toplama bilgisayarı kromatografik bilgileri işlemek, depolamak ve raporlamak için HPLC cihazı ile bütünleşik yazılımlar içerir. Bilgisayar dedektörün her maddeye verdiği elektirik sinyalini koordine eder ve sinyali yorumlanabilir bir kromatograma çevirir.
