HPLC, analitik araştırma ve kalite kontrol laboratuvarlarında önemli bir yere sahiptir. Hem üretim süreçleri hem de araştırma bulgularının yayınlanması ile ilgili önemli kararlar, yalnızca HPLC sistemi tarafından üretilen verilere yüksek derecede güvenilirlik yerleştirilebildiği takdirde ulaşılabilecek kararlara dayanmaktadır.
HPLC, çok bileşenli bir sistemdir, bu nedenle sonuçların doğruluğu ve güvenilirliği, her bir bileşen parçasının performans düzeyine bağlıdır. Bu makale, sonuçların daha fazla güvenilir olmasına katkıda bulunacak bazı öneriler sunmaktadır. Kolaylık sağlamak için her bir bileşen parçasının katkısı ayrı bir başlık altında tartışılmıştır.
Mobil Faz
Mobil fazın temel rolü, enjekte edilen numuneyi kolona taşımak ve kolonda ayrıldıktan sonra, tanımlama ve miktar tayini için ayrı bileşenleri detektöre aktarmaktır. İdeal olarak, bir mobil faz, analiz ve HPLC başlamadan önce taze olarak hazırlanmalıdır ve HPLC dereceli solventler kullanılmalıdır. Çözücüler, asılı parçacıklardan arındırılmış olmalıdır. Başlangıçta çözücüleri 0.45 μ filtre kullanarak vakum altında filtrelemek önemlidir. Herhangi bir kalıntı asılı partikülü çıkarmak için çevrimiçi filtrelerin de aktif olarak kullanılması önerilir. Mobil faz çözücüleri birbiriyle tamamen karışabilir olmalı ve enjekte edilen numune de mobil faz ile iyi derecede karışabilir olmalıdır. Tamponları mobil faz bileşenleri olarak kullanırken, tamponun sistem içinde kalmasına ve kurumasına asla izin vermeyin çünkü sistemde kalan tuzlar pompa bileşenlerine zarar vermenin yanı sıra birikerek mobil fazın serbest akışını engelleyecektir.
Mobil Faz Hazırlarken
- Kullanılan kimyasalların son kullanma tarihlerini control edin
- Kimyasalların uygun koşullarda saklandığından emin olun (Sıcaklık, nem, ışık vb.)
- Kimyasalların kontamine olmadığından emin olun
- Kimyasalları doğru sırada, doğru karıştırma hızında ve süresinde karıştırın
- Temiz cam malzemeler kullanın
- Tampon ve organik solvent karışımlarından oluşan mobil fazları süzün ve degaze edin.
- Bir tuz tampon hazırlayacaksanız daime tuzu önce sui le çözün ve ardından organic solvent ekleyin
Örnek Hazırlama
Mobil faz çözücüleri gibi, numuneyi enjeksiyondan önce filtrelemek iyi bir uygulamadır.
Büyük hacimli enjeksiyonlar, pik şekil bozulmalarına neden olacağından, büyük hacimli enjeksiyonlar yaparak kolonlara aşırı yüklenmemelidir.
Ne zaman yeni bir yöntem geliştirilecekse, örneğin mobil faz ile uyumluluğunun kontrol edilmesi tavsiye edilir. Çözünürlüğün düşük olması durumunda, hareketli faz karışımının polaritesine uyan bir çözücü veya çözücü kombinasyonu deneyin.
Örnek Hazırlanken;
- Analitik terazilerin, pH metrelerin günlük doğrulamalarının ve yıllık bakım ve kalibrasyonlarının yapıldığından emin olun
- Kullanılan terazilerin ,pH metrelerin, tartım ve numune hazırlama kaplarının temiz olduğundan emin olun
- Tartım aralığınıza uygun terazi kullanın. Tartım işlemlerinizde doğru tartım tekniklerini uygulayın
- Mikropipetlerinin yıllık kalibrasyonlarının yapıldığını kontrol edin. Mikropipetinizle uygun bir pipet ucu kullanın ve doğru mikropipet kullanım tekniklerini uygulayın.
- Numunelerinizi çözeltinizin karakterine uygun bir şırınga ucu filtre ile süzün
- Işıktan etkilenen numuneleri amber renkli malzemelerde hazırlayın
- Tartımlan numunlerinizin iyice çözündüğünden emin olun. Uygun bir karıştırma prosedürü izleyin.
- Ön saflaştırma gerekli numuneleri uygun saflaştırma protokolü ile saflaştırın. İyi uygulanmamış bir saflaştırma protokolü tubing, enjektör iğnesi ve kolon tıkanmaları ile sonuçlanabilir.
Kolon
Kolon HPLC sisteminin önemli bir bileşenidir. Uygun bakımı ve kullanımı, sonuçların yüksek güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlayacaktır.
Kolona ani ve yüksek akış hızı vermekten kaçının. Çalışma akış hızları ve basınçları, bu tür değişikliklerin durağan faz dolgu malzemesini bozmaması için kademeli olarak değiştirilmelidir. Ani basınç değişikliklerinden kolonu korumak için bir koruma / ön kolon kullanılması önerilir. Koruma kolonlarının (Ön/Guard Kolon) kullanılması, yabancı maddelerin analitik kolona girmesini de önleyecektir. Mobil fazın akışı sıcaklığa bağlı olduğundan, akış hızının tutarlılığı için sabit bir kolon sıcaklığını korumak için bir kolon fırınının kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Kolonu Kullanırken;
- Üreticinin önerdiği kolon kullanım talimatlarını uygulayın
- Kolon kullanım pH aralığı, sıcaklığı ve en yüksek basınç değerlerini iyi öğrenin ve kolonu bu derler aralığında kullanın
- Kolonu ilk kez kullanıyorsanız üreticinin önerdiği kolon ilk kullanım açılış talimatını uygulayın.
- Kolonları her kullanımdan önce ve sonra uygun prosedürlerde yıkayın ve uygun organic solventler ile saklayın.
- Kolonlar kullanılmadığı zamanlarda daima kolon tıpaları takılı bir şekilde saklanmalı. Aksi durumda silika yapıları kuruyacak ve kolon performansınız önemli ölçüde azalacaktır.
- Kolonlara ani ve yüksek basınç vermeyin.
- Kolonlara kolon yükleme kapasitesinin üzerinde enjeksiyon yapmayın.
- Kolonlara karakteristik yapısını bilmediğiniz numuneleri enjekte etmekten kaçının.
Pompa
Pompanın, mobil faz akışının tutarlılığını sağlaması ve analiz çalışması boyunca solvent bileşimini koruması gerekir. Gradyan analizi durumunda, yazılım programına göre mobil fazın bileşimini korumak için bir pompa gereklidir. Pompanın sağlıklı çalışabişmesi için mobil fazın doğru hazırlanmış olması, systemin kullanım öncesi ve sonrasi iyi temizlenmiş olması ve pompa bakımlarının zamanında ve eksiksiz yapılmış olamsı gerekmektedir. Bu tür koşullar, pompa bileşenlerine zarar gelmesini önleyerek ve herhangi bir görünür hasar fark edildiğinde bu tür bileşenlerin zamanında değiştirilmesiyle sağlanır. Duruma göre ara polariteli solventler ile veya saf su ile pompayı kademeli olarak yıkayın.
Pompa Kullanımında,
- Sistemde hiçbir zaman tampon çözelti bırakmayın. Sistem kullanıldıktan sonra tüm hatları %100 su ve ardından orgaik solvent su karışımı veya sadece organic solvent ile yıkayın. Eğer system uzun süre kullanılmayacaksa %100 organik solvent ile yıkamak önerilmemektedir. Uzun süre kullanılmayan sistemlerde organic solvent buharlaşabilir.
- HPLC sistemininiz yıllık bakımlarını düzenli olarak yaptırın.
Enjektör/ Otomatik Örnekleyici
Enjeksiyon hacimlerinin tutarlılığı, sonuçların tekrarlanabilirliği için birincil ihtiyaçtır. Manuel enjektörler, sabit hacimli numune döngülerinden oluşur ve otomatik modlarda enjeksiyon şırıngası, operatör müdahalesi olmadan hacim tutarlılığını korur.
Önceki analizden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için özel dikkat gösterilmelidir. Manuel enjektörler olması durumunda, enjeksiyon döngüsünü her zaman yeterli numune ile yıkayın. Otomatik enjeksiyon yapmanız durumunda, ara yıkama döngülerinin analiz programının bir parçası olduğundan emin olun. Analize başlamadan önce numunenin ve standart yeniden kullanılabilir şişelerin temizliğinin doğrulanması hayati önem taşır.
Işık Kaynakları
HPLC analizinin çoğu, UV ışık kaynağı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu tür ışık kaynaklarının faydalı bir ömrü vardır. Tedarikçinin tavsiyelerine göre lamba değişimi, absorbans değerlerinin yüksek derecede tekrarlanabilirliğine katkıda bulunacaktır.
Dedektörler
Bir dedektör, farklı numune bileşenlerinin varlığını doğrulayan ve aynı zamanda bunların nicelleştirilmesine yardımcı olan HPLC sisteminin nihai parçasıdır.
Dedektörün tekrar kullanılmadan önce periyodik olarak çevrim dışı olarak temizlenmesi ve su ve mobil faz ile yıkanması tavsiye edilir. Dedektör hücre duvarlarında olası hasarları önlemek için çalışma basıncı aralığı asla aşılmamalıdır.
Dedektörleri Kullanırken;
- Akış hücrelerinin en yüksek basınç değerlerinin üzerinde bir akışı direct dedektöre göndermeyin.
- Her kullanımdan sonra HPLC sistemi ile birlikte dedektörü de yıkayın
- Dedektör lamba ömrünüzü control edin. Lamba ömrünüzün daha uzun süre gitmesi için kullanılmadığı zamanlarda dedektörü kapatın.
- Dedektörü havalandırma kanalı gibi alanların altına konumlandırmayın
Makalede sunulan öneriler sonuçların kalitesini kesinlikle artıracaktır, ancak sistemin referans bileşiklere karşı periyodik olarak kalibrasyonunun yerini hiçbir şeyin alamayacağını söylemeye gerek yoktur.
Orhan Çakan
