HPLC, bir karışımdaki bileşenleri ayırmak, tanımlamak ve ölçmek için laboratuvarlarda kullanılan güvenilir ve yerleşik bir tekniktir. HPLC analizinde mobil fazlarda ve numune hazırlamada su kullanılmaktadır. Su, çoğu maddeyi çözdüğü için evrensel bir çözücüdür, ancak içerdiği kontaminantlardan dolayı laboratuvar uygulamalarında sıradan musluk suyu kullanılamaz. Hatta sıradan bir filtrasyon prosesinden de geçmiş su kallanılamaz.
Su kirleticileri, çözünmüş atmosferik gazları, doğal mineralleri ve organik maddeleri, çözünmüş katıları ve süspansiyonları ve bunları desteklemek için gerekli besinler ve çevresel koşullar mevcutsa bakteri veya mikroorganizmaları içerir.
Laboratuvar kullanımı için su, gerekli uygulamalar için farklı derecelerde filtrasyon prosesleri gerektirir.
Reaktif sınıfı su, prosedürün özgüllüğüne, doğruluğuna ve kesinliğine müdahale etmeyecek şekilde belirli bir prosedürde kullanıma uygun su olarak tanımlanır. HPLC analizi için ultra saf veya HPLC dereceli su veya ASTM tarafından belirtilen Tip 1 su kullanılır.
Uygun kromatografik dedektörler ile trilyonda bir birim (ppt) kadar düşük eser konsantrasyonlardaki bileşikler kolayca tanımlanabilir. HPLC teknikleri çevresel, adli tıp, ilaç, gıda ve endüstriyel kimyasallar gibi örneklere uygulanabilir. Bu analizler de ppt düzeyinde hassasiyet gerektirir. Bu da su kalitenizin bu hassasiyetlere girişim yapmayacak saflıkta olması anlamına gelir.
HPLC Dereceli Su Nedir?
HPLC dereceli su, düşük UV absorbansına sahip ultra saf sudur ve burada spesifik iletkenlik (16-18 mega ohm) su arıtma sistemleri tarafından korunur. Genellikle 0.22 mikronluk bir filtreden süzülürler ve kontaminasyonu önlemek için inert bir atmosfer altında solventle durulanmış kaplarda kapatılırlar.
HPLC Saflıkta Su Artıma Sistemleri
HPLC analizi için kullanılan su, ters ozmoz, iyon değişimi, damıtma, filtrasyon, ultraviyole ışınlama ve diğer yöntemlerin bir kombinasyonu ile saflaştırılmalıdır.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi için genel kurallara ilişkin Japon Endüstri Standardı, HPLC suyunun analize müdahale etmeyecek bir kaliteye sahip olması gerektiğini belirtir . Ayrıca HPLC sınıfı su , toplam organik bileşik (TOC), spesifik direnç ve absorbans değerleri gibi indeks değerlerine göre değerlendirilmelidir.
HPLC Suyunun pH'ı Nedir?
HPLC ve diğer laboratuvar çalışmalarında, doğru sonuçlar için kararlı ve tekrarlanabilir bir pH'ı korumak hayati önem taşır. Ultra saf su ile çalışırken, pH'ı belirlemek için sudaki iyonları tespit eden laboratuvar elektrotlarıyla pH'ı basitçe değerlendiremezsiniz. HPLC su, düşük ve kararsız düzeyde iyon içeren ve elektrot okumasını güvenilmez hale getiren ultra saf sudur. İlk üretildiğinde pH değeri yaklaşık 6.99 olan ultra saf su zamanla bekledikçe havadaki karbondioksitin su içerisinde bikorbonta ve buradan da karbonik asite dönüşmesi sonucu pH değerini asidik yönde düşürür. Bu da ultra saf suyun pH değerinin kararsız olmasına neden olur. Özellikle pH’ın önemli olduğu analitik çalışmalarda tamponlama yapmak gerekir. Ayrıca bu nedenden dolayı ultra saf suyu anlık üretmek gerekir. Bir diğer detay da HPLC suyunun direnci pH 7'nin üzerine çıktıkça azalır.
Tip 1 Su Özellikleri
Reaktif su, suyun saflığını tanımlamak için nicel özelliklere sahiptir. Bu özellikler Amerikan Test ve Malzemeler Derneği (ASTM) tarafından tanımlanmıştır. Tip 1 su , karışık yataklı deiyonizasyon ve 0.2μ membran filtrelerle filtrasyon gerektiren ultra saf su olarak da adlandırılır. Tip 1 su için standart özellikler burada özetlenmiştir:
özdirenç | >250C'de 18 megohms(mΩ) |
TOK | < 5ppb |
silika | <3ppb |
Sodyum | <1 ppb |
klorür | <1 ppb |
bakteri |
HPLC için su ve eser metal analizi gibi uygulamalar, ASTM tarafından Tip 1 kapsamında belirtildiği gibi en yüksek saflıkta su gerektirir. HPLC saflıkta suya , sulu mobil fazlar, tamponlar ve numune ve standart çözeltilerinin hazırlanması sırasında ihtiyaç duyulur . Laboratuvarlar, solvent tedarikçilerinden HPLC kalitesinde su temin edebilir veya bir su arıtma sistemi kurabilir.
Çoğu zaman, kromatograflar sulu mobil faz hazırlığı için HPLC dereceli şişelenmiş su kullanır. Şişelenmiş ultra saf suyun, çok sayıda ve yüksek arka plan tepe noktalarına sahip suyun kromatogramlarını olumsuz yönde etkileyebilecek yüksek TOC (Toplam Organik Karbon) seviyelerine sahip olduğu bulunmuştur. Bu nedenle önerimiz HPLC analizlerinizde şişelenmiş su yerine bir ultra saf su üretim cihazı kullanmanız ve suyunuzu anlık olarak taze üretmeniz yönündedir.
Su Kirleticilerinin HPLC Analizlerinize Etkisi
Sudaki kirleticiler, HPLC'nin çalışmasını birçok yönden etkileyebilir. HPLC için sudaki kirleticilerin çalışmalarınızı nasıl etkileyebileceğini kısaca inceleyelim:
Katı Partiküller;
İzin verilen sınırların üzerindeki katı parçacıklar, pompalara ve enjektörlere zarar verebilir. Contaların, valflerin ve pompa pistonunun artan aşınması ve yıpranması, HPLC kolon ömrünüzün azalmasına yol açabilir. Uzun vadede, kolon fritlerinin tıkanması, kolon geri basıncını arttırarak mobil fazın yavaşlamasına ve hatta tamamen durmasına neden olabilir.
Kolloidler
Kolloidler, sabit faz üzerinde geri dönüşümsüz olarak adsorbe olabilir ve kolon ayırma etkinliğini azaltabilir. Kolonda tıkanmalara sebebiyet verebilir. Hayalaet pik olarak adlandırdığımız kromatografik girişimlere yol açabilir.
Organikler
HPCL suyunun organik kontaminasyonu, kromatografik ayrımları çeşitli şekillerde etkileyebilir:
Organik moleküllerin kromatografi kolon dolgu maddesi partiküllerinin yüzeyinde birikmesi, numune ve çözücü moleküllerinin sabit faz üzerindeki bağlanma bölgelerine erişimini azaltabilir ve bu da çözünürlük kaybına neden olabilir.
Kromatografik ayırmalar için kullanılan suda organik moleküllerin varlığı, analitik kromatografinin duyarlılığını azaltabilir. Bunun nedeni, eluent olarak kullanılan sudaki organik moleküllerin, kromatografi sabit faz dolgu maddesi partikülleri üzerindeki aktif gruplara bağlanmak için numune molekülleri ile rekabet edebilmesidir. Sonuç olarak, elüsyon işlemi sırasında daha az numune molekülü bağlanır. Bu da birincil olarak pik şiddetinde ve pik şekillerinde bozulmalara sebebiyet verebilir.
Organikler ayrıca yabancı hayalet tepe(ler)e de katkıda bulunabilir.
Yüksek düzeyde organik kontaminasyon mevcutsa, kirleticiler yeni bir durağan faz gibi davranabilir ve bu da alıkonma süresi kaymasına ve pik kuyruk oluşumuna neden olabilir.
İyonik Girişimler
İyonlar ayrıca kromatografik ayrımları da etkileyebilir. Çözeltinin iyonik gücündeki herhangi bir değişiklik, polar moleküllerin ayrılma sırasını etkileyebilir. Ayrıca nitratlar ve nitritler gibi UV emici iyonlar hayalet tepeler olarak ortaya çıkabilir ve bu nedenle veri analizini zorlaştırır.
Leachables (Sızıntılar)
Yüksek kaliteli suyun depolanması genellikle kaplardan sızan bileşiklerin ortaya çıkmasına neden olur. Plastik kaplar organikleri süzebilir, cam kaplar ise HPLC mobil fazlarının veya tamponlarının uzun süreli depolanmasında iyon girişimlerine neden olabilir. Tüm bu girişimler kromatogramlarda hayalet pikler, baseline gürültüsünün artması, baseline yükselmesi gibi sonuçlar doğurabilir.
Gazlar
Mobil fazda çözünmüş hava, HPLC su sisteminde karşılaşılan yüksek basınçlar altında çok küçük kabarcıkların oluşmasına neden olur. Bu tür kabarcıklar, dedektör gürültüsüne ve kolondaki boşluklara katkıda bulunur.
Bu nedenle, mobil fazı ve tamponları hazırlama sırasında ve hat filtrelerini kullanarak pompalamadan önce filtrelemek kesinlikle gereklidir. Çevrimiçi gaz giderme veya harici teknikler kullanılarak gazdan arındırma eşit derecede önemlidir.
HPLC Suyun Ticari Kaynakları
Tanınmış kimyasallar ve reaktifler tedarikçileri, HPLC için şişelerde su sağlar, ancak uzun vadede, HPLC'nin yanı sıra diğer karmaşık analitik teknikler için su gereksinimlerinizi karşılayacak, ticari olarak mevcut dağıtma ünitelerinin kurulması tavsiye edilir ve ekonomik olarak uygulanabilir.
Bu tür sistemler, büyük hacimli çıktılar için tasarlanmıştır ve elde tutulan kontrollü dağıtım, dahili depolama tankı içindeki seviyeleri gösteren ve harici dökülmeleri önleyen sensörler gibi diğer faydalı özellikleri sağlar.
Sistem bileşenleri normalde 0,2 μ boyutun üzerindeki çözünmüş katıların çıkarılması için filtrasyon öncesi ve sonrası kapsülleri içerir. Aktif karbon filtreler, organik maddelerden ve çözünmüş klordan arındırma sağlar. Karışık yataklı deiyonizerler iletkenliği kontrol eder ve UV ışınlama kaynağı organik kalıntıları giderir. Ters ozmoz sistemi ve su depolama tankı bu sistemleri tamamlamaktadır.
Özetle;
Doğru, tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar için doğru su kalitesi ile çalışmak hayati öneme sahiptir. Nasıl ki bir insanın damarlarında dolaşan kanın kalitesi sağlığının göstergesi ise HPLC sisteminin tubinglerini de damarlara benzetecek olursak, bu damarlarda dolaşan suyun kalitesi analiz sağlığınız açısından oldukça önemlidir.
Doğru su, güvenilir analiz demektir….
Orhan Çakan
