HPLC Kolon Performansının İyileştirilmesi İçin Öneriler

Bir HPLC kolonu, yüzlerce enjeksiyondan sonra bile yüksek oranda tekrarlanabilir performans verme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, sınırlı bir ömre sahiptir ve bir süre sonra performansı , pik şekillerinin bozulması ve pikler arasındaki rezolüsyon, kolon geri basıncındaki düzensiz artış ve hayalet piklerin kromatgoramlarda tespiti ile bozulmaya başlar. Bu tür anormallikler, önerilen kullanım uygulamalarının benimsenmesi ve HPLC kolonlarının bakımı ile önlenebilir.

HPLC'yi anlatırken genelde insan vücudundan örnekler veririz. Çünkü; neredeyse her bir parçası insanın bir uzvu ile benzer özellikler taşır.
Kolonları ise insan bağırsağına benzetiyoruz. Yediğimiz birçok besinin ayrıştığı ve faydalı formlarının vücuda alındığı bir fabrika. Hatta ikinci beyin olarak dahi bahsediliyor. Yedikleriniz ne kadar saf, organik, katkısız ve doğal ise bağırsak sağlığınız o kadar iyi olacak ve dolayısı ile tüm vücudunuzun sağlığı da bu oranda iyileşecek veya kötüleşecektir.
Bu açıdan baktığımızda kolonlar da bizim için aynı işlevi görür. Kolona giren sıvı faz ve numune tıpkı gıdaların bağırsağımızda yaptığı etkiye benzer etkiler yapar.
Eğer kullandığınız solventler saf değilse, sisteminizi ve kolonunuzu doğru yıkamıyor ve şartlamıyorsanız, kolonda tampon bırakıyorsanız vb. gibi birçok parametre kolon performansınızı etkileyecektir.

Unutmayın, çalışmalarınızın sağlığı ve analizlerinizin güvenilirliği kolonunuzun sağlığından geçer.

Bu makalemizde kolon kullanımı için kısa ip uçları ve rejenerasyonu için birkaç yöntemden bahsadeceğiz. 

Bir kolon, aşırı yükleme veya uyumsuz mobil fazların kullanımı nedeniyle kirlenirse rejenere edilebilir, ancak hasarlı veya kullanım ömrünü doldurmuş bir kolon rejenere edilemez ve değiştirilmesi gerekir.

Kolonları kullanırken dikkat etmeniz gerekenler;

• Her kolonun dolgu maddesinin bir pH kullanım aralığı vardır. Özellikle yoğun kullanılan C18 kolonlarda bu genel olarak 2-8 aralığındadır. Kolonu bu aralık dığında kullandığınızda kolon dolgu maddesine zarar verirsiniz. 
• Kolonun maksimum kullanım sıcaklığını aşmamak. Genel olarak birçok kolon 55-65 °C civarlarına kadar mekanik dayanım gösterebilir. Bu sıcaklığın üzerinde yine kolon kimyası bozulacaktır. 
• Kolonların maksimum çalışma basıncının üzerine çıkmamak ve kolona ani yüksek basınçlar vermekten kaçınmak. Her kolonun maksimum çalışabileceği bir basınç vardır. Bu basınçların üzerinde dolgu maddeniz zarar görecektir. Ayrıca ani yüksek basınçlarda ise kolon girişindeki silika yapısı bozulacak bu da pik şekillerinize olumsuz bir etkide bulunacaktır. 
• Özellikle C18 kolonları %100 su ile yıkamaktan kaçının. Su çok polardır ve çok apolar olan dolgu maddenizin apolar gruplarına zarar verir. Yine bunun sonucu olarak pik şekillerinde, rezolüsyonda ve teorik plaka sayınızda olumsuz yönde değişmeler olacaktır. 
• Kolonları hiçbir zaman %100 su ve tamponda bırakmayın. Bu kolonda mikrobiyal üreme ve tuzların çökmesi gibi durumlar sonucu kolon tıkanmalarına yol açabilir. 

Ters Faz Kolonları

Ters faz ayrımı, HPLC ayrımlarının çoğunda kullanılan ana çalışma modudur. Dolgu maddesleri genel olarak C18, C8, C4, CN, NH2 ve fenil sabit fazlarından oluşur. Rejenerasyon işleminde sırayla aşağıdaki solventler kullanılarak 10 ila 20 kolon hacmi solvent ile elüsyon yapılması önerilir.

• Ultra saf su
• Asetonitril
• İzopropanol
• Heptan
• İzopropanol
• Asetonitril
• Mobil faz

Akış hızı ise 0.5-2 ml/dk aralığında kolon basıncı dikkate alınarak optimum bir düzeyde tutulmalıdır. Kolon sıcaklıgı ise 30-55 °C aralığında tutulabilir. Dikkat etmemiz gereken önemli detay kolon maksimum çalışma basıncını ve sıckalığını geçmemektir.

HPLC kolonlarının ortak boyutları için dengeleme süreleri için örnek bir tablo aşağıda belirtilmiştir:

Ters Faz (Protein/Peptit ayrımları)

• Tamponsuz 20 hacim mobil faz ile yıkayın ve ardından
• Suda %0.1 TFA
• Asetonitril/izopropanol (1:2) içinde %0,1 TFA
• Son olarak kullanılacak mobil faz ile dengeleyin

Normal faz sütunları (Amino, diol, nitro, amino durağan fazlar)

Kolonu her bir basamakta en az 20 kolon hacmi ile yıkayın

• Heptan
• Izopropanol
• Asetonitril
• Suçlu
• İzopropanol
• Heptan

İyon Değişimi Kolonları

SAX, SCX, WAX, WCX gibi hem katyon hem de anyon değiştiricilerden oluşan iyon değiştirme kolonları için önerilir. Kolonu her bir basamakta en az 20 kolon hacmi ile yıkayın.

• pH 7'de 20 hacim 500 mM fosfat tamponu
• % 10 asetik asit
• 5 hacim su
• pH 7'de 10 hacim fosfat tamponu
• 5 hacim su
• 10 hacim metanol
• 10 hacim su
• Mobil faz

GPC/GFC Kolonları

• pH 3'te 5 kolon hacmi 0.1 fosfat tamponu
• Güçlü bir şekilde tutulan proteinler kullanılıyorsa, sudan asetonitrile ve suya 60 dakikalık bir gradyan kullanın.

Kolonların Depolanması

Kolonun rejenerasyonundan hemen sonra kullanılmaması durumunda aşağıdaki saklama prosedürleri önerilir:

• Gecelik – son kullanılan mobil fazda saklanabilir
• Haftada 2-3 gün – mikrobiyal büyümeyi önlemek için suyla yıkayın
• Uzun süreli saklama (birkaç ay) – asetonitril gibi aprotik solventlerde saklayın.

Kullanımdan Önce Kolon Performansının Tespiti;

Rejenerasyondan sonra bile, standart bileşik enjeksiyonları kullanarak teorik bir plakaya sayısı, simetri faktörü ve alıkonma zamanları, rezolüsyon gibi performans parametrelerini doğrulayarak rejenere edilmiş bir kolonun performansını doğrulamak önemlidir.

Aslında bu doğrulama tüm rutin analizlerimizin bir parçasıdır. Analizlerinizde system uygunluk parametreleri olarak her analiz öncesi bu kriterler e daha fazlası ile kolon performansınızı control etmiyorsanız bu kriteri kesinlikle protokolünüze eklemelisiniz.

Ayrıca doğrulama yaptığınız her bir parametreyi de bir kolon takip çizelgesi ile kayıt altına alıp izlenebilirlik kazandırmalısınız. Bu sizin o kolon ile ilgili bir önceki analizdeki performansı ile mevcut analizinizdeki performansını karşılaştırmak için önemlidir. Böylece kolonun gidişatını görmüş ve performansını belgelemiş olursunuz.

Orhan Çakan