1- HPLC'ye Genel Bakış;
HPLC, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinin kısaltmasıdır. "Kromatografi" bir ayırma tekniğidir, "kromatogram" kromatografinin sonucudur ve "kromatograf" kromatografi yapmak için kullanılan araçtır.
Kromatografi için geliştirilen çeşitli teknolojiler arasında, kolon adı verilen moleküler ayırmaya yarayan cihazlar ve çözücüyü sabit bir akış hızında iletmek için yüksek performanslı pompalar, kromatografların temel bileşenlerinden bazılarıdır.
İlgili teknolojiler daha karmaşık hale geldikçe, yaygın olarak Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi olarak adlandırılan sistem, basitçe "LC" olarak anılmaya başlandı. Günümüzde, yüksek hızda analiz yapabilen Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC veya UHPLC)’ de daha yaygın hale gelmiştir.
HPLC ile sadece solventlerde çözünen bileşikler analiz edilebilir. HPLC, sıvı bir numunede çözünen bileşikleri ayırır ve numunede hangi bileşenlerin ve her bir bileşenin ne kadarının bulunduğunun kalitatif ve kantitatif analizine izin verir.
Şekil 1, HPLC işlemine temel bir genel bakışı göstermektedir. HPLC analizi için bir sıvı numunedeki bileşenleri ayırmak için kullanılan çözücüye mobil faz denir.
Mobil faz, sabit faz olarak bilinen bir ayırma kolonuna ve ardından çözücü dağıtım pompası tarafından kontrol edilen sabit bir akış hızında dedektöre iletilir. Kolona belirli bir miktar numune enjekte edilir ve numunenin içerdiği bileşikler ayrıştırılır. Kolonda ayrılan bileşikler, kolonun aşağı akışındaki bir detektör tarafından tespit edilir ve her bir bileşik tanımlanır ve nicelenir.
Şekil.1 HPLC'ye Genel Bakış
2- HPLC Bileşenleri;
Bu başlıkta"HPLC’ye Genel Bakış"(Şekil 1'de gösterildiği gibi) ve mekanizmaları ele alınmıştır.
Daha ayrıntılı olarak, HPLC bir solvent dağıtım pompası, bir gaz giderme ünitesi, bir numune dahil olmak üzere çeşitli bileşenlerden oluşur.
Enjektör, kolon fırını, dedektör ve veri işlemcisi Şekil 2, HPLC akış diyagramını ve her bir bileşenin rolünü göstermektedir.
Şekil.2 HPLC Akış Şeması
HPLC'ye sisteminde, pompa mobil fazı kontrollü bir akış hızında iletir(a). Hava, içinde yaşadığımız standart atmosfer basıncı altında mobil fazda kolaylıkla çözülebilir. Mobil fazda hava kabarcıkları bulunursa ve basma pompasına girerse, debi dalgalanmaları ve taban hattı gürültüsü/kayması gibi sorunlar meydana gelebilir. Gaz giderme ünitesi, mobil fazda(b) hava kabarcıklarını ortadan kaldırarak bu sorunun önlenmesine yardımcı olur. Çözünmüş hava uzaklaştırıldıktan sonra hareketli faz kolona verilir. Numune enjektörü daha sonra mobil faza (c) standart bir solüsyon veya numune solüsyonu verir. Sıcaklık dalgalanmaları, kolondaki bileşiklerin ayrılmasını etkileyebilir. Kolon, sıcaklığı sabit tutmak için bir kolon fırınına yerleştirilir(d). Kolondan ayrıştırılan bileşikler, kolonun(e) çıkışına yerleştirilmiş bir detektör tarafından tespit edilir. Bir veri toplama ve işleme bilgisayarı, bileşik(f)'yi belirlemek, miktarlamak amacıyla bir kromatogram elde etmek üzere dedektörden gelen sinyalleri işler.
3- HPLC'de Ayırma;
HPLC, her bir bileşiğin kolondaki fiziksel etkileşimlerinin farklılığından yararlanarak her bir bileşiği ayırabilir ve tespit edebilir. Şekil 3, HPLC ayrımının bir örneğini göstermektedir.
HPLC için iki faz vardır: mobil faz ve sabit faz. Mobil faz, hedef bileşiği çözen sıvıdır. Sabit faz, hedef bileşik ile etkileşime giren kolonun sabit dolgu maddesidir.
Kolonda, bileşen ve mobil faz arasındaki afinite (örn; van der waals kuvveti) ne kadar güçlüyse, bileşen mobil faz ile birlikte kolon boyunca o kadar hızlı hareket eder. Öte yandan, durağan faz ile afinitesi ne kadar güçlü olursa, kolon boyunca o kadar yavaş hareket eder. Şekil 3, sarı bileşenin hareketli faz ile güçlü bir afiniteye sahip olduğu ve kolon boyunca hızla hareket ettiği, pembe bileşenin ise durağan faz ile güçlü bir afiniteye sahip olduğu ve yavaşça hareket ettiği bir örneği göstermektedir. Kolondaki elüsyon hızı, bileşik ve durağan faz arasındaki afiniteye bağlıdır.
Şekil.3 HPLC Ayırma Örneği
4- Kromatogram Nasıl Okunur;
"Kromatogram" kelimesi, kromatografi yoluyla elde edilen bir çizim anlamına veya renkli fotoğraf anlamına gelir.
Şekil 4, bir kromatogram örneğini göstermektedir. Kromatogram, dedektör sinyal yoğunluğu açısından konsantrasyonu gösteren dikey eksen ve analiz süresini temsil eden yatay eksenden oluşan iki boyutlu bir çizimdir. Kolondan hiçbir bileşik ayrıştırılmadığında yani sadece mobil fazın sinyali alğılanığında yatay eksene paralel bir çizgi çizilir. Buna taban çizgisi (base line) denir. Dedektör, elüsyon bandındaki hedef bileşiğin konsantrasyonuna göre yanıt verir. Elde edilen sinyal, bir üçgenden ziyade bir çan şekline benzer. Bu şekle "tepe (pik)" denir.
Alıkonma süresi (tR), numune enjeksiyon noktası ile pikin tepe noktası arasındaki zaman aralığıdır. Tutulmayan bileşiklerin (durağan faz için etkileşimi olmayan bileşikler) enjektörden dedektöre gitmesi için gereken süreye ölü zaman (t0) denir.
Tepe yüksekliği (h), bir pikin tepe noktası ile taban çizgisi arasındaki dikey mesafedir ve açık mavi renkle boyanmış pik alanı (A), tepe ve taban çizgisi tarafından çevrelenen alandır. Bu sonuçlar, bir numunenin bileşenlerinin kalitatif ve kantitatif analizi için kullanılacaktır.
Şekil.4 Kromatogram ve İlgili Terimler
Çeviri Makale Kaynağı: shimadzu.com/an/service-support/technical-support/analysis-basics/basic/what_is_hplc.html
