Tamponlar, ters fazlı HPLC ayrımlarında önemli bir rol oynar. pH'daki değişiklikler, numune moleküllerinin iyonlaşma derecesini etkiler.
Polar olmayan moleküllerde pH değişimi minimumdur, ancak doğası gereği asidik veya bazik olan polar moleküller de pH değişimi önem kazanır.
pH'ın değiştirilmesi, iyi ayrılmamış piklerin ayrımını sağlamak için etkili bir şekilde kullanılabilir veya hatta tam tersi olarak iyi ayrılmış piklerin çakışmasına yol açabilir. Bu nedenle, tamponların kullanılması yoluyla pH'ın kontrolü, yakın ayrım gösteren veya çakışan piklerin ayrılmasını iyileştirmeye yardımcı olur.
Makalede kısaca ele alınan tamponların kullanımı yoluyla pH kontrolüne katkıda bulunan birkaç temel faktör vardır.
Tampon Seçimi
Eldeki bir uygulama için uygun tamponun seçimi, pka, pH aralığı ve UV cut off değeri gibi tampon özellikleri tarafından yönetilir. Bu parametrelerin değerleri referans makalelerde ve uygulama notlarında kolayca bulunabilir.
Genel bir kural olarak pH tamponları, pka değerinin +/- 1 birimi içinde kullanılmalıdır. Bu aralık içinde tamponlar, pH'ı değiştirmeye yönelik her türlü kasıtlı girişime direnir. Örnek olarak, 4.8 pka değerine sahip bir tampon, 3.8-5.8 pH aralığında etkili bir şekilde kullanılabilir. UV cut off değeri, analiz dalga boyunun tampon absorbansına müdahale etmemesi gerektiği için de dikkate alınmalıdır.
Tampon pH'ı
Silika bazlı kolonlar pH aralığı 2.0-8-0 dışında kullanılmamalıdır. pH 2.0'ın altında organik bağlı faz kaybı olabilir ve diğer yandan 8.00'in üzerindeki pH değerleri sabit fazın silika omurgasının daha fazla çözünürlüğüne neden olabilir. Bu tür uygulamalar için diğer dolgulara sahip kolonlar faydalı olabilir.
Tampon Konsantrasyonu
Tampon konsantrasyonuna karar vermek, yöntem geliştirme için önemlidir. İdeal olarak, tekrarlanabilir sonuçlar veren en düşük konsantrasyon seçilmelidir. Daha yüksek konsantrasyon, polar moleküllerin daha hızlı elüsyonuna yol açar. Genellikle tampon konsantrasyonu 0.005 M'dan düşük olmamalıdır.
Bu konsantrasyonun altında aktif bir tampon olarak kalmayabilir. Tampon konsantrasyonu yükseltildiğinde, kolon geri basınçlarını artırabilen tampon viskozitesinde artış olabilir. Kolonda tamponun çökmesi sonucu tıkanmalar olabilir. Normalde konsantrasyon 0,005 ila 0,1M aralığında tutulmalıdır.
Tampon Çözünürlüğü
Tampon, çözücüde tamamen çözünür olmalıdır. Daha yüksek konsantrasyonlarda, mobil fazın organik bileşeni ile temas halinde çökelme meydana gelebilir. Bu tür çökmeler, pompalarda, tubinglerde çalışma sorunlarına ve kolonların tıkanmasına neden olabilir.
Tampon Çözeltilerin Hazırlanması
Ölçülü balonda gerekli miktarı tartın ve gerekli çözücüyü eklemeye başlayın. Şişeyi gerekli işarete kadar (menisküs çizgisi) doldurmadan önce çözeltinin pH'ını ayarlayın. Gerekli organik fazın eklenmesine başlamadan önce pH ayarı yapılmalıdır. Ardından, rutin analitik uygulamalar için 0,45μm filtreden ve UHPLC uygulamaları için 0,22μm filtreden solüsyonu filtreleyin. Ardından ultrasonic banyoda yeterli süre tutuktan sonra sisteme takabilirsiniz.
Bu, herhangi bir katı süspansiyonun uzaklaştırılması için gereklidir. Tamponlar hazırlandıktan sonra en kısa sürede kullanılmalı ve kullanımdan önce herhangi bir katı veya bakteriyel süspansiyon gözlenirse atılmalı ve taze olarak hazırlanmalıdır.
Tamponların, HPLC ayrımlarının çoğunda çok önemli bir rol oynadığı görülebilir . Yöntem geliştirme genellikle tamponların dikkatli seçimini ve hazırlanmalarında yeterli özeni gerektirir.
Metot geliştirme ve tampon çözeltiler hakkında bunları ve daha fazla bilgiyi edinmenizi sağlayacak “Sıvı Kromatografisi (LC) Sisteminde Analitik Metot Geliştirme Eğitimi” için tıklayınız.
Orhan Çakan
