Tek bir solvent, HPLC kullanılarak gerçekleştirilen ayırma gerekliliklerini nadiren karşılar. Çoğu durumda, iki veya daha fazla çözücünün karıştırılması gerekir.
İzokratik işlemde bileşim önceden belirlenir ve analitik çalışma sırasında değişmeden kalır. Öte yandan, gradyanlı elüsyonda nihai çözücü bileşimi, ilk bileşimden çok farklıdır ve değişiklikler, analiz sırasında programlanır.
İzokratik modda çözücü karışımları hazırlanır ve karıştırma çevrim dışı yapılır. HPLC mobil faz çözücülerinin karıştırılmasına ilişkin hususlar çevrim dışı olarak karıştırılacak olan tek tek çözücülerin fiziksel özelliklerinin rolünü tartışır. Bu makale, sonuçların tutarlılığını sağlamak için aynı karıştırma uygulamasını benimsemenin önemini tartışmaktadır.
Stokiyometrik karıştırma, nadiren elde edilen bir hedeftir. Hacimsel ölçüm hataları ortadan kaldırılsa bile karıştırma ısısı solventlerin tam olarak karışmasını engeller. Isı biçimindeki enerji, çözücülerin fiziksel olarak karıştırılması sırasında ya emilir ya da serbest bırakılır. Bu, çözücülerin karışım hacminde değişikliklere yol açan sıcaklık değişiklikleriyle sonuçlanır.
Metanol ve asetonitril, HPLC'de yaygın olarak kullanılan iki çözücüdür.
Metanol, suyla karıştırıldığında, karıştırıldıktan sonra hacmi artırabilen ısının serbest kalmasına neden olur. Öte yandan asetonitril su ile karıştırıldığında ısının emilmesiyle sonuçlanır ve bu da soğumaya ve karışık hacmin büzülmesine neden olur. Bu tür bileşim varyasyonları, numune moleküllerinin ayırma özelliklerinde gözlemlenebilir varyasyonlara sahip olan karışımların polaritesinde gözle görülür değişikliklerle sonuçlanır.
Çözücüler İçin Karıştırma Uygulamaları
Çözücülerin karıştırılması temelde kolay olan basit bir işlemdir. Yaygın olarak benimsenen iki karıştırma uygulaması şunlardır:
Ayrı Hacimsel Ölçümler;
Örnek olarak, % 60 su ve % 40 metanol içeren bir litre metanol ve su karışımı hazırlamanız gerektiğini varsayalım. Bu yöntemde 600 ml su mezür ile ölçülür ve bir behere aktarılır. Daha sonra mezür ile 400 ml metanol ölçülür ve aynı behere suyun üzerine ilave edilir. Karışım homojen bir şekilde karışması için manyetik karıştırıcıda karıştırılır. Karıştırma ısısı nedeniyle sıcaklık artışı, nihai hacmin 1000 ml'nin üzerinde olmasına neden olacaktır. Ancak bu yöntemde hazırlık süreci yaklaşık 5-10 dakikada gibi bir süreçte tamamlanacaktır.
Hacme Tamamlama Yaklaşımı;
Nihai hacmimiz 1000 ml olduğu için bu yaklaşımda 1000 ml’lik balon joje kullanmamız gerekir. Yukarıda örnek verilen aynı çözeltiyi hazırlamak bu yöntemde mezür ile 400 ml metanol ölçülür ve balon jojeye ilave edilir. Ardından su ile hacmi 1000 ml işaretine kadar tamamlanır. Metanol ve su karışımlarının ekzotermik olduğunu unutmayın. Çözelti ısınacak ve hacmi değişecektir. Hacme tamamlama öncelikle menisküs çizgisinin 1-2 cm altına kadar yapılır ve çözelti oda koşullarına soğutulduktan sonra son hacmine su ile tamamlanır. Çözelti karıştırılır ve ultrasonic banyodan geçirilerek analize hazır hale getirilir. Bu işlem çözeltinin oda koşullarına tekrar soğutulmasını da içerdiği için 15-25 dakika gibi bir süreçte tamamlanacaktır.
Teorik olarak her iki yöntem de çözücülerin karıştırılması gereksinimlerine hizmet eder, ancak hacimsel varyasyonların her iki yöntem için farklı olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, ayırmaların tutarlılığı için aynı karıştırma yöntemini benimsemek önemlidir.
Tampon hazırlarken ise pH, organik faz ile karıştırılmadan önce sulu fazda ayarlanır. Eğer organik faz ile karıştırma sonrası pH ayarı yaparsanız nihai pH değerinizden sapmalar olacaktır. Bu da özellikle pH'a bağımlı elüe olan moleküllerin alıkonma zamanlarında sapmaya neden olacaktır.
Online karıştırma durumunda ise %100 saf çözelti HPLC sisteminin ayrı ayrı hatlarına yerleştirilir ve pompa orantı valfleri (GPV) yardımıyla istenilen oranda karıştırılır. Yazılım aracılığıyla karıştırma ısısı için düzeltmeler uygulandıktan sonra neredeyse stokiyometrik karıştırma mümkündür.
Ayrıca mobil faz hazırlarken karıştırma süresi, sıcaklığı, hızı ve ultrasonik banyoda tutma süresi gibi parametreler de önemlidir. Bunlar nihai organik solvent oranının buharlaşma yoluyla azalmasına yol açabilecek faktörlerdir. Eğer olması gerekenden uzun sürelerde bu işlemler yapılıyorsa organik faz ortamdan uzaklaşacak ve oranı değişecektir. Daha kısa süreler ise iyi bir karışım ve çözünme işleminin olmaması ile sonuçlanacaktır. Bu da kromatogramlarınızda alıkonma sürelerinde kayma, rezolüsyon kayıpları gibi onlarca farklı problem ile karşılaşmanız demektir.
Hangi yöntemi seçtiğinizden çok, bu süreçleri ne kadar standardize ettiğiniz önemlidir. Yani hazırladığınız çalışma talimatlarında mobil faz hazırlığını tüm detatları ile yazmak, tercihi kullanıcıya bırakmamak oldukça önemlidir.
Örneğin mobil fazımızın %70’lik methanol’den oluştuğunu düşünelim. Bunu analitik yöntemlerimize yazarken birçok farklı ifade biçimi olsa da genelde iki şekilde belirtiriz.
- Bir mezür ile 300 ml su alınır ve 1 ml’lik behere aktarılır. Ardından mezür ile 700 ml HPLC dereceli metanol ölçülür ve ultra saf su üzerine eklenir. Ardından oda ısısında 300 rpm’de 5 dk. Karıştırılır ve yine oda ısısında ultrasonik banyada 1 dk tutulduktan sonra sisteme enyekte edilebilir.
- %70 Metanol-%30 Su çözeltisi hazırlanır.
A yaklaşımında çalışanın inisiyatifine hiçbir şey bırakılmamış ve böylece süreç kullanıcıdan bağımsız olarak standardize edilmiştir. Bu açıdan çok daha tutarlı sonuçlar verecektir.
Fakat; B yaklaşımında solvent seçimi dışında tüm süreç çalışanın inisiyatifine bırakılmıştır. Kimi %70’lik çözeltiyi beherde A yöntemi gibi hazırlayacak, kimi ise aynı çözeltiyi yukarıda anlattığımız hacme tamamlama yöntemi ile hazırlayacaktır. Hatta karıştırma süresi, hızı gibi diğer önemli parametreler de çalışanın inisiyatifindedir. Bu açıdan bakıldığında B yönetimi standardize değildir ve çalışanın yaklaşımına göre farklı sonuçlar doğuracak, çalışanlar arası tekrarlanabilirliğe olumsuz yönde etki edecektir.
Burada mobil faz hazırlarken kullanıdğımız kimyasallar kadar, hazırlama yöntemimizin de oldukça önemli olduğunu görüyoruz. Analizler arası tutarlı sonuçlar için bu maddeler ve daha fazlasına dikkat etmeniz gerektiğini unutmayın.
Orhan Çakan
